正確認(rèn)識(shí)糞大腸菌群

1.糞大腸菌群
糞大腸菌群作為地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)唯-一的一項(xiàng)微生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)，我國(guó)多用多 管發(fā)酵法進(jìn)行檢測(cè)，近幾年也更新了好幾個(gè)相關(guān)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)。

糞大腸菌群是總大腸菌群中的一部分，用來(lái)表明水質(zhì)受污染的程度，主要來(lái)自糞便。糞大腸菌群是一類能使乳糖發(fā)酵、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，在44.5 ℃培養(yǎng)24~48ｈ能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。
通過(guò)對(duì)糞大腸菌群的監(jiān)測(cè)，可了解水體受生活污水污染的狀況。糞大腸菌群適 用于河流、湖泊等地表水、企業(yè)污水及醫(yī)院廢水的監(jiān)測(cè)，是綜合評(píng)價(jià)城 鎮(zhèn)污水，尤其是生活污水污染的一個(gè)*的重要指標(biāo)。


２ 樣品的采集和保存
2.1 樣品采集
采樣人員大多缺乏細(xì)菌學(xué)監(jiān)測(cè)知識(shí)，出現(xiàn)很多采樣不規(guī)范的現(xiàn)象。如：微生物項(xiàng)目水樣和理化水樣混采；滅菌瓶開(kāi)蓋時(shí)間過(guò)早、水樣在空氣中暴露 時(shí) 間 過(guò) 長(zhǎng)；水樣采集量過(guò)滿（既容易導(dǎo)致水樣中細(xì)菌缺氧死亡，又不利于水樣檢測(cè)前振蕩搖勻）；微生物樣品和其他理化項(xiàng)目同時(shí)采樣時(shí)，沒(méi)有做到細(xì)菌樣品優(yōu)先采集；采樣人員在采集樣品時(shí)，沒(méi)注意避免采樣瓶受雜菌污染（手接觸到瓶蓋和瓶頸、采樣設(shè)備不規(guī)范）。
2.2 采樣瓶的準(zhǔn)備和存放
采集糞大腸菌群的采樣瓶需要用牛皮紙封包好后，再經(jīng)過(guò)高壓滅菌器滅菌才能使用。滅菌后的采樣瓶里如果含有少量冷凝水，可以放在烘箱里烘干。有條件的單位，也可以使用無(wú)菌采樣瓶。滅菌后的采樣瓶也有其保存期，超過(guò)兩周內(nèi)未使用就必須重新滅菌。絕大部分實(shí)驗(yàn)室都是在*滅菌后不再管其使用期 限。采樣瓶存放過(guò)久可能受到雜菌污染。
2.3 樣品運(yùn)輸保存
在樣品的運(yùn)輸和保存過(guò)程中，樣品的冷藏是關(guān)鍵（溫度過(guò)高過(guò)低都不利于樣品的保存）。由于儀器設(shè)備條件不夠，運(yùn)輸過(guò)程不滿足樣品所需溫度或者路途遙遠(yuǎn)，送檢時(shí)間超過(guò)６ｈ，都會(huì)導(dǎo)致樣品失效。樣品交接時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（在樣品送入實(shí)驗(yàn)室之后，采樣人員要將采樣記錄移交給業(yè)務(wù)室，然后由接樣員對(duì)水樣進(jìn)行編號(hào)并將檢測(cè)任務(wù)下發(fā)到監(jiān)測(cè)室），導(dǎo)致樣品沒(méi)有及時(shí)分析而超過(guò)時(shí)限。特別是，在執(zhí)法監(jiān)測(cè)和污染源監(jiān)督性監(jiān)測(cè)中，需要的采樣時(shí)間長(zhǎng)，有時(shí)還需 要 分 時(shí) 間 段 監(jiān) 測(cè)，這過(guò)程很容易造成樣品超時(shí)。并且，樣品保存時(shí)間越長(zhǎng)越不能保證樣品在合格的冷藏溫度下。這幾年，經(jīng)常出現(xiàn)企業(yè)和監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)因該項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)的特殊性發(fā)生糾紛。建議在采集細(xì)菌樣時(shí)，車上安裝車載冰箱、冷藏箱或者其他冷藏設(shè)備，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溫度。加入冰塊保存時(shí)，樣品不可以直接接觸冰塊。不能保證樣品在有效期內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室分析時(shí)，可以考慮使用剛剛出臺(tái)的酶底物法（HJ1001-2018）進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)。
３ 實(shí)驗(yàn)室分析
3.1 試劑質(zhì)量
3.1.1 培養(yǎng)基
培養(yǎng)基的質(zhì)量是整個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的保障，是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。分 析人員可能認(rèn)為只要培養(yǎng)基在保質(zhì)期內(nèi)，都是合格的，而忽略了對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量控制。

培養(yǎng)基需在濕度低、溫度不超過(guò)３０ ℃的房間避光保存，避免雜菌侵入。配置前，應(yīng)該觀察培養(yǎng)基顏色和體積，變化明顯時(shí)廢棄不用。配好的培養(yǎng)基需要在２ｈ內(nèi)進(jìn)行高壓滅菌；對(duì)于不能及時(shí)滅菌的培養(yǎng)基，可以在冰箱內(nèi)存放且不超過(guò)一天，因?yàn)闇缇患皶r(shí)，就會(huì)影響其殺菌效果和營(yíng)養(yǎng)成份的含量。培養(yǎng)基滅 菌結(jié)束后應(yīng)迅速冷卻，避免長(zhǎng)時(shí)間保存在滅菌鍋內(nèi)，容易造成滅菌過(guò)度從而影響培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分。配置的培養(yǎng)基不宜存放過(guò)久，堅(jiān)持多配少量的原則，盡 量在一周內(nèi)用完為好。每批培養(yǎng)基在使用前，都應(yīng)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量鑒定，只有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證合格的培養(yǎng)基，才能投入使用。

3.1.2無(wú)菌水
目前很多實(shí)驗(yàn)室采用先配置所需量的稀釋水到試管中再統(tǒng)一滅菌。在實(shí)驗(yàn)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)由于稀釋水在高壓滅菌和冰箱存放這一系列過(guò)程中揮發(fā)，導(dǎo)致稀釋水在做樣時(shí)達(dá)不到所需的量。建議先用大容量玻璃瓶統(tǒng)一準(zhǔn)備足量的無(wú)菌水和100ｍL的量筒，使用時(shí)在無(wú)菌環(huán)境下按所需量進(jìn)行分裝。無(wú)菌水的配制盡量在當(dāng)天或?qū)嶒?yàn)前一天配置，-好實(shí)驗(yàn)當(dāng)天進(jìn)行配制。無(wú)菌水需要調(diào)pH值、可在常溫保存。

3.2 操作方法
3.2.1 稀釋倍數(shù)  
有時(shí)候，企業(yè)污水、醫(yī)療廢水等糞大腸菌群污染嚴(yán)重的水樣需要稀釋到10-4～10-5ｇ／mL之后接種，但分析人員不能準(zhǔn)確判斷其大致稀釋倍數(shù)，容易出現(xiàn)超出或者低于定量范圍?，F(xiàn)行的環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法與有關(guān)技術(shù)規(guī)范中糞大腸菌群檢數(shù)表里所列的幾個(gè)不定值（“＜”或“＞”）給監(jiān)測(cè)工作帶來(lái)一定的困難。能否選擇出正確的稀釋度是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。

接種的稀釋比，為了避免在實(shí) 測(cè) 數(shù) 據(jù) 中 出 現(xiàn) 不 定值，實(shí)驗(yàn)分析人員應(yīng)充分了解自己所做區(qū)域各種水樣的稀釋比，根據(jù)待檢水樣的環(huán)境因素和水樣性質(zhì)確定合適的稀釋比。采樣人員盡量將樣品性質(zhì)、受污染程度在采樣記錄上描述清楚，以供分析人員選擇合適的分析方法。對(duì)于不確定稀釋范圍的水樣，可以進(jìn)行多種梯度稀釋。

3.2.2 結(jié)果判讀
在使用多管發(fā)酵法測(cè)試時(shí)，如果在初發(fā)酵試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣，可以適當(dāng)?shù)匮娱L(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間到48ｈ。

在使用酶底物法測(cè)試時(shí)，在培養(yǎng)24ｈ后結(jié)果為可疑陽(yáng)性或者無(wú)顏色反應(yīng)，可 適 當(dāng) 延 長(zhǎng) 培 養(yǎng) 時(shí) 間 到28ｈ進(jìn)行結(jié)果判讀，超過(guò)28ｈ之后出現(xiàn)的 顏 色 反 應(yīng) 不 作 為陽(yáng)性結(jié)果。如果樣品有背景顏色，需做一個(gè)空白試驗(yàn)，與標(biāo)準(zhǔn)盤(pán)作比較。如果加入培養(yǎng)基，樣品顏色過(guò)深，可能是余氯過(guò)多或者pH值過(guò)低的原因，這種方法就不適用了。

４ 質(zhì)量控制
4.1 空白和平行性

以前使用的多管發(fā)酵法、濾膜法等對(duì)空白和平行性沒(méi)有明確的要求。大部分實(shí) 驗(yàn)室也于對(duì)每批樣進(jìn)行空白測(cè)定。

無(wú)論用哪種方法檢測(cè)，建議每個(gè)月要對(duì)實(shí)驗(yàn)室用水做質(zhì)量檢測(cè)，每批樣品要用無(wú)菌水做全程序空白和實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。使用酶底物法分析時(shí)，對(duì)20個(gè)樣品或每批次樣品測(cè)定一個(gè)平行雙樣。
4.2 質(zhì)控措施
糞大腸菌群項(xiàng)目的監(jiān)測(cè)起步比較早，但是之前一直作為非標(biāo)項(xiàng)目，糞大腸菌群的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株也是在近兩年才興起。大部分實(shí)驗(yàn)室分析人員之前沒(méi)有接觸過(guò) 質(zhì)控，也沒(méi)有接受過(guò)這方面知識(shí)的培訓(xùn)，在近兩年密碼樣考核和實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)中，該項(xiàng)目的效果不是很好。

目前國(guó)內(nèi)使用的有證標(biāo)準(zhǔn)菌株幾乎都是從國(guó)外購(gòu)買的，價(jià)格貴、購(gòu)買渠道復(fù)雜且不易保存。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室很少有達(dá)到對(duì)每批樣品 使 用 有 證 標(biāo) 準(zhǔn) 菌 株 進(jìn) 行 陽(yáng) 性、陰性對(duì)照試驗(yàn)。微生物的質(zhì)控、盲樣制作難度較大，影響了國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室關(guān)于微生物方面質(zhì)量控制的開(kāi)展。盡管如此，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)該盡量做到，定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行質(zhì)量控制，使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行陰陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。酶底物法要求，每年至少必須進(jìn)行６次定量試驗(yàn)、４次定性試驗(yàn)