組織自發(fā)熒光淬滅劑-操作指南

描述：許多組織會(huì)產(chǎn)生可透過各種波長(zhǎng)濾光片的內(nèi)源性自發(fā)熒光，顯著干擾抗體標(biāo)記熒光觀察甚至導(dǎo)致免疫組化染色失敗。自發(fā)熒光淬滅試劑中的離子可通過碰撞方式捕獲自發(fā)熒光光源分子發(fā)出的電子，阻止該電子從激發(fā)態(tài)回歸基態(tài)和能量釋放，從而淬滅自發(fā)熒光。采用優(yōu)化的孵育時(shí)間，可以最大限度地消除自發(fā)熒光而不明顯影響抗體標(biāo)記的熒光。


 

適用：各種組織、細(xì)胞免疫熒光染色的自發(fā)熒光消除。特別適用于神經(jīng)組織自發(fā)熒光淬滅。

儲(chǔ)存：4 oC避光。

使用方法：

以下步驟在免疫熒光組化染色完畢之后(而非在熒光染色完畢之前)執(zhí)行。對(duì)特定的組織和細(xì)胞類型，必需優(yōu)化孵育時(shí)間以便最大限度淬滅自發(fā)熒光而不明顯影響抗體標(biāo)記的熒光(步驟2)。請(qǐng)仔細(xì)閱讀后面的說明。

1. 吸去PBS或相應(yīng)洗滌緩沖液，用蒸餾水短暫沖洗組織切片或細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞。

2. 加入適量但充足的自發(fā)熒光淬滅劑覆蓋組織切片或瓶皿中的細(xì)胞。室溫孵育10-90min。

3. 吸去自發(fā)熒光淬滅劑，用蒸餾水短暫沖洗。

4. 吸去蒸餾水，用PBS覆蓋組織切片或位于細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞。

5. 封片。建議使用抗熒光衰減封片劑。該封片劑可防止抗體標(biāo)記熒光衰退。

6. 熒光顯微鏡觀察。

說明：

1.   不同物種不同類型組織的自發(fā)熒光具有不同的特征，使用組織自發(fā)熒光淬滅劑的效果可能會(huì)有差別。另外，任何針對(duì)自發(fā)熒光的淬滅，將會(huì)在一定程度上降低抗體熒光強(qiáng)度。所幸的是該試劑對(duì)自發(fā)熒光的淬滅程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出抗體熒光強(qiáng)度的降低，因而能在二者之間獲得較好的平衡。由于不很清楚的原因，本試劑對(duì)于消除腦脊髓神經(jīng)組織的自發(fā)熒光具有更好的效果。

2.   為獲得最佳效果，必需優(yōu)化孵育時(shí)間以便最大限度淬滅某一特定組織的自發(fā)熒光而不明顯影響抗體標(biāo)記的熒光(步驟2)。重要的標(biāo)本應(yīng)在確定最佳孵育時(shí)間之后使用本試劑。進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，可取數(shù)張組織切片或位于培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，在免疫熒光組化染色完畢之后加入組織自發(fā)熒光淬滅劑，孵育5、10、30、60、90分鐘等不同時(shí)間，沖洗后觀察熒光。如果組織自發(fā)熒光仍然很強(qiáng)，可延長(zhǎng)孵育時(shí)間；如果孵育時(shí)間小于10分鐘而熒光消退十分明顯，可將孵育時(shí)間減少為1-5分鐘，或者取少量的組織自發(fā)熒光淬滅劑加等份的雙蒸水稀釋，然后孵育10-90分鐘進(jìn)行優(yōu)化。

3.   組織自發(fā)熒光淬滅劑必須在完成免疫熒光組化染色后使用，否則將嚴(yán)重降低抗體熒光。