明膠酶譜法檢測試劑盒染色步驟

本試劑盒采用凝膠反相酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性及其無活性前體酶原譜系。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達1 nM，高于ELISA方法，其基本原理和程序是：制備含有膠原酶底物的SDS-PAGE凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳，電泳時SDS與樣本中的MMP可逆性結合，導致MMP氫鍵和疏水鍵破壞而不能發(fā)揮分解明膠的作用。電泳結束后取出凝膠與酶反應Buffer孵育，MMP恢復活性，凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應緩沖液，可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測靈敏度~1nM。試劑盒可進行25-50次標準小膠檢測（如果樣本MMP含量高，孵育時間短，不用換液可最多50次），如果小膠加樣孔為10~15個，則總計可最多檢測500~750個樣品。

MMP透明條帶的大小、位置和酶譜的圖例。注意因為樣品未還原和加熱變性，條帶位置并不對應推算的蛋白分子量。下圖1，正常血漿樣品陽性對照可能出現(xiàn)的反相顯示的透明條帶位置：66kDa(MMP-2)，72kDa(proMMP-2)，87kDa(MMP-9)，92kDa(proMMP-9)，注意血漿中只有很少量的激活狀態(tài)的66kDa的MMP2，增加上樣量在ProMMP2下面隱約可見(最右側泳道)。

不同于正常血漿MMP酶譜，每種組織樣品(如牙周膜韌帶組織)都具有自己特定的MMP活性酶譜，部分proMMP9(92kDa)可能會結合一個25kDa微球蛋白形成MMP9復合物，條帶位置約125-130kDa，其二聚體條帶大約在215-225kDa位置(圖中并未顯現(xiàn))，多聚體條帶位置240kDa，嚴格說他們都是MMP9復合體，但也有人稱其為proMMP-9。注意在這種組織activeMMP9活性低，但activeMMP2活性高，與血漿MMP活性酶譜形成了鮮明的對比

條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示，并盡量設置為黑色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中最常見的格式。

常規(guī)考馬斯亮藍SDS-PAGE 凝膠蛋白質染色是實驗室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度高，但所需試劑復雜并且有毒有害，操作步驟繁瑣，難以控制獲得好的染色效果。

染色步驟：

1. 此染色液即為工作液，使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝

膠，并緩慢搖動2h；

2. 傾去染色液，用脫色液沖洗凝膠；

3. 以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動2h，傾去脫色液，再加入新脫色液進行脫色，直至獲得清晰的藍色的條帶和干凈的背景（通常此過程需要2～4h，也可脫色過夜至清晰的藍色的條帶和干凈的背景）；

4. 對凝膠進行分析和照相，凝膠可放置在7％的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置對凝膠進行處理后保存。