透射電鏡全套（包埋+制片+拍照）實(shí)驗(yàn)

項(xiàng)目介紹

透射電鏡（TEM）通過對(duì)組織細(xì)胞樣本進(jìn)行樹脂包埋切片，60-80nm厚度的超薄切片，經(jīng)過重金屬鉛、鈾染色后于透射電子顯微鏡中進(jìn)行幾千至幾萬倍的放大成像，從而能夠清楚的觀察到在普通光學(xué)顯微鏡下無法看清的動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，比如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、自噬小體、凋亡小體、葉綠體、液泡、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌或病毒侵染等結(jié)構(gòu)及病理變化。透射電鏡超薄切片除了能夠顯示細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)之外，還可用于觀察病原微生物，如各類細(xì)菌真菌等。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)、病毒學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)、材料科學(xué)等諸多研究領(lǐng)域，是觀察和研究物質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的強(qiáng)有力工具。

信帆生物透射電鏡平臺(tái)主要設(shè)備包括超薄切片機(jī)Leica EM UC7，透射電鏡HITACHI HT7700 80kv，透射電鏡HITACHI HT 7800 80kv。其中透射電鏡HITACHI HT7700、HITACHI HT7800主要技術(shù)指標(biāo)如下：

　　分辨率：1.0nm(加速電壓120kV，晶格像)

　　放大倍數(shù)：200～200,000 高反差模式

　　4000～600,000 高倍模式

　　50～1,000 低倍模式

　　加速電壓：40-120KV

　　實(shí)驗(yàn)流程

　　包埋-制片-拍照

　　送樣運(yùn)輸要求

　　送樣時(shí)請(qǐng)下載詳細(xì)填寫附件中的送樣單并與樣品一起送達(dá)信帆生物超微病理實(shí)驗(yàn)室。

1、 動(dòng)物組織樣本

① 1-3min內(nèi)取樣，取材前可提前準(zhǔn)備裝有電鏡固定液的培養(yǎng)皿，將小組織塊離體取下后立即投入培養(yǎng)皿內(nèi)，在培養(yǎng)皿的固定液中進(jìn)行切割成小塊，取樣組織體積控制在以下尺寸(1mm×1mm×1mm正方體、1mm×1mm×3mm長方體狀、1mm×2mm×3mm薄片狀)。固定液滲透能力有限，超出此范圍后組織會(huì)無法固定，后續(xù)實(shí)驗(yàn)無法完成，務(wù)必請(qǐng)重視此過程

② 取材時(shí)盡量精確到需要觀察的目的部位（如觀察腎小球取腎皮質(zhì)；觀察胰島取胰島豐富的胰尾；皮膚，腸胃等在固定液中易打卷的組織可將組織粘在濾紙上進(jìn)行固定）。

③ 取材時(shí)一定注意避免鑷子擠壓等機(jī)械損傷，刀片要鋒利避免挫傷組織。

④ 組織取下后立即投入電鏡固定液內(nèi)室溫避光固定2h，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。4°時(shí)樣本可保存1個(gè)月左右

2、 植物組織樣本

① 取材要求同動(dòng)物組織樣本。

② 組織投入固定液后需要進(jìn)行真空抽氣讓組織沉底，如無條件抽氣可用濾紙將組織塞進(jìn)固定液內(nèi)，組織不能漂浮在固定液表面。（抽氣做出來的效果會(huì)好一些）

3、 細(xì)胞樣本

貼壁細(xì)胞：

（看細(xì)胞凋亡的，需要把培養(yǎng)液中的細(xì)胞也離心收集后固定）

方法一：消化法（實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟簧婕坝^察細(xì)胞膜相關(guān)的內(nèi)容如：觀察緊密連接）

①培養(yǎng)好的細(xì)胞（細(xì)胞密度不超過70%）棄培養(yǎng)基，加入胰-酶消化。

②胰-酶消化好后（時(shí)間不宜過長），加培養(yǎng)基終止消化，吸管輕輕吹打至細(xì)胞起浮。吸入離心管，低速離心（不超過3000轉(zhuǎn)），3-5min左右，細(xì)胞團(tuán)要有綠豆大小。

③棄上清，加入電鏡固定液（固定液需提前恢復(fù)至室溫），細(xì)胞團(tuán)吹散重懸。

④室溫避光固定30min，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4°℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

方法二：刮取法

①培養(yǎng)好的細(xì)胞（細(xì)胞密度不超過70%）棄培養(yǎng)基，加入電鏡固定液（固定液需提前恢復(fù)至室溫）。

②常溫避光固定5min左右，用細(xì)胞刮（或軟橡膠蓋切得平整小方塊）沿一個(gè)方向輕輕刮下細(xì)胞，切記不要反復(fù)刮，避免細(xì)胞刮破。

③用巴氏吸管把細(xì)胞液吸入離心管內(nèi)，放入離心機(jī)（不超過3000轉(zhuǎn)），低速離心3-5min左右，細(xì)胞團(tuán)要有綠豆大小。

④棄固定液后加新的電鏡固定液，細(xì)胞團(tuán)吹散重懸。

⑤室溫避光固定30min，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞要肉眼可見細(xì)胞沉淀有綠豆大小，棄培養(yǎng)基后加電鏡固定液室溫避光固定30min，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

4、 細(xì)菌樣本

長于固體培養(yǎng)基的細(xì)菌：連帶著培養(yǎng)基一起挑下細(xì)菌放于電鏡固定液內(nèi)室溫避光固定30min，再轉(zhuǎn)移至4℃保存， 4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

懸浮細(xì)菌孢子等：離心收集細(xì)菌要肉眼可見細(xì)菌沉淀綠豆大小，棄培養(yǎng)基后加電鏡固定液室溫避光固定30min，再轉(zhuǎn)移至4℃保存，4℃冰袋運(yùn)輸，在保存和運(yùn)輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

5、 病毒

破碎組織細(xì)胞，粗離心去除細(xì)胞碎片取上清，超速離心分離出病毒（病毒提取的過程需要客戶自己完成）。用緩沖液（如PBS）懸浮病毒，體積至少50ul，遠(yuǎn)距離干冰凍存運(yùn)輸，近距離4℃保存運(yùn)輸，盡快滴片做負(fù)染后及時(shí)電鏡觀察拍照。（噬菌體 4度運(yùn)輸）

6、 外泌體囊泡等

客戶自己完成外泌體囊泡等的提取收集，用緩沖液（如PBS）或者試劑盒中的保存液懸浮，，體積至少50ul，遠(yuǎn)距離干冰凍存運(yùn)輸，近距離4℃保存運(yùn)輸，盡快制片做負(fù)染后及時(shí)電鏡觀察拍照。（因此類樣品極易降解，樣品越新鮮越好，最好數(shù)小時(shí)內(nèi)完成滴片負(fù)染，否則做出的效果很不理想甚至觀察不到）

7、 納米材料等無機(jī)材料

直接準(zhǔn)備粉劑，或用純水或無水乙醇懸浮，常溫保存運(yùn)輸即可（需要超聲的備注）。做負(fù)染后電鏡觀察拍照。